• 因为“毒蜘蛛”是“蜘蛛侠”的影子式人物，就像是他在水中的倒影，所以山姆·雷米在挑选演员的时候特意选了与马奎尔外形相近，但更帅气的托弗·格雷斯。
• 托比·马奎尔本身受到慢性脊椎疾病的困扰，但他在本片完成的动作场景，是前两部加起来的四倍。
• 《蜘蛛侠2》（2004）中，托比·马奎尔就觉得蜘蛛衣舒服多了，尤其是裤子的胯下部分……这一点还特别在“蜘蛛侠”坐电梯的那部分场景“声明”了一下。马奎尔表示，第三集的蜘蛛衣不但条纹更加清晰，更有质感，最重要的是鞋底舒服多了，再不会无故磨破袜子。
• 托比·马奎尔的未婚妻詹妮弗·梅尔是环球公司主席的女儿，职业是珠宝设计师。彼得在本片中送给玛丽·简的心形的小金盒就是詹妮弗·梅尔亲自设计的。
• 布莱丝·达拉斯·霍华德亲自拍摄了起重机事故现场的特技动作，当时并没有意识到自己已经怀孕。
• 片中克斯汀·邓斯特所有的尖叫都是《蜘蛛侠2》（2004）中的尖叫声的循环利用。
• 拍摄的很多内容都没有放入发行的DVD里，其中包括彼得（穿着他的黑色蜘蛛皮）将罪犯卷起然后把他们吊起来的蒙太奇镜头、队长斯泰西和埃迪·布洛克的对峙场面（当格温·史黛西在她父亲家抛弃了他时），还有彼得在镜子中看到噩梦般的毒液朝他大叫大嚷后崩溃的场景。
• 本片曾一度被认为会分为上下两部上映。
• 本片制作时间为2年10个月。
• 金发的克斯汀·邓斯特饰演一头红发的玛丽·简，而红发的布莱丝·达拉斯·霍华德则饰演了一头金发格温·史黛西。
• 毒液发出的一段声音是袋獾的叫声。
• 本片是2007年北美票房冠军。
• 当托弗·戈瑞斯穿着毒液戏服的时候，休息期间一点水都不喝，因为穿着这套戏服没法上厕所。
• 据詹姆斯·弗兰科说，因为试映观众觉得动作戏份不够足，他们不得不在上映之前返工重拍。
• 本片的上映日期甚至在《蜘蛛侠2》（2004）上映前就已经决定了。
• 这是88岁的克里夫·罗伯逊在2011年9月10日逝世前的最后一部电影。
• 伊丽莎·库斯伯特和斯嘉丽·约翰逊都曾是格温·史黛西的人选。
• 埃迪的台词：“我的蜘蛛感官正在震颤……如果你知道我在说什么的话！”这句向MJ致敬的台词是托弗·戈瑞斯的主意。
• 哈里的实验室里有他父亲的绿魔面具，和漫画中金色的鬼怪面具一样。
• 詹姆森办公室的其中一个场景，背景中的一份报纸上写着“章鱼博士仍然在逃”。